研究要点

冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）能够对水合状态下的高分子进行亚纳米分辨率成像，为精准解析其结构与在溶液中的演化过程提供了一种有力手段。然而，高分子材料的电子辐照损伤限制了其cryo-TEM成像的分辨率和质量。这种损伤主要源于高能电子与高分子及其周围玻璃化冰层相互作用产生的活性自由基。这些自由基会引发一系列化学反应，导致高分子结构的分解和破坏。自由基清除剂可以捕获活性自由基并终止其链式反应，因此有望减轻电子辐照对高分子结构的破坏。其中，抗坏血酸是一种典型且高效的自由基清除剂，能够有效捕捉羟基自由基和其他活性氧自由基。目前，自由基清除剂作为样品保护剂，已经在低温X射线衍射、干态TEM和液腔TEM等实验中得到了成功应用，然而其在冷冻电镜实验中的有效性仍然缺乏研究。

基于此，本研究探索了抗坏血酸钠（SA）作为自由基清除剂对高分子cryo-TEM成像效果的影响。研究发现，SA将胶原纤维的抗电子辐照能力提高了40%以上，同时对于纤维素和脱铁铁蛋白等富含羟基的高分子也有着类似的保护效果，其效果显著优于其它几种自由基清除剂。通过单颗粒分析，研究人员发现脱铁铁蛋白在加入0.5 M SA后仍能保持完整的三维结构，显示该方法有助于高分子的cryo-TEM成像分辨率和质量。

图文解读

图1.添加SA对于胶原纤维电子辐照耐受性的影响。

如图1所示，在不添加SA时，胶原纤维对于电子辐照非常敏感，在当电子辐照剂量达到20 e^-/Ų时，其微观结构即遭到破坏；而当剂量达到200 e^-/Ų时，严重的辐照损伤会使得胶原纤维周期性结构的界面处产生大量的气泡。在添加0.1 M SA后，胶原纤维的结构更加稳定，同时气泡的形成也得到了明显抑制。快速傅里叶变换（FFT）定量分析结果显示，添加0.1 M SA可以使胶原纤维的细微结构能够耐受104 e^-/Ų的辐照，同时产生气泡的辐照剂量也增加到了280 e^-/Ų，比未添加SA的情况分别高出117%和43%。这些结果表明SA有效减轻了电子辐射对胶原纤维结构的损伤。研究人员发现，SA对于同样含有大量羟基的纤维素和脱铁铁蛋白也具有显著的保护作用，显示了该方法的普适性；但对于缺乏羟基的样品，如脂质体，SA则并未体现出明显的保护作用。

图2.胶原纤维在不同浓度的自由基清除剂作用下的cryo-TEM图像。

研究人员对不同浓度的SA、NaCl、NaNO₃和甘油等自由基清除剂的效果进行了比较。结果表明，0.1 M SA对胶原纤维保护效果最佳，优于NaCl和NaNO₃，这和它们与羟基自由基的反应速率常数有关，如抗坏血酸根与羟基自由基的反应速率常数比氯离子高一个数量级，因此能够更有效地清除自由基，进而保护胶原纤维的稳定性。值得注意的是，使用过量的SA会降低其保护性能，这应该是由于大量的SA在电子辐照下会产生新的自由基。此外，研究人员发现甘油反而会降低胶原纤维的稳定性，这很可能是由于甘油自身的不耐辐照性。

图3. 加入0.5 M SA后脱铁铁蛋白的单颗粒重构结果

为了验证SA对高分子样品精细结构的影响，研究人员分别对不含SA和含0.5 M SA的脱铁铁蛋白进行了单颗粒采集实验。结果显示，加入SA后，脱铁铁蛋白的结构在电子辐照下更为稳定。三维重构结果显示，加入SA后的脱铁铁蛋白分辨率（2.20 Å）略高于未加入SA的样品（2.28 Å），且未破坏其对称结构，氨基酸残基的局部密度与原子模型也仍旧能保持的匹配。这些结果表明，加入SA可以提高蛋白质精细结构在电子辐射下的稳定性，从而获得更高分辨率的cryo-TEM结果。

总结与展望

该工作成功使用SA提高了高分子样品在cryo-TEM实验中的辐照稳定性，从而为获取更高质量的cryo-TEM表征结果提供了一种有效的策略。值得注意的是，在应用该方法后，高分子样品精细结构的电子辐照耐受性仍只有约100 e^-/Ų，尚无法完全满足高分辨cryo-TEM和冷冻电子断层扫描（cryo-ET）实验的需求。研究人员希望在未来的实验中找到更加有效的样品保护剂，从而进一步提升高分子样品的辐照稳定性。

本工作发表于《Macromolecules》期刊，论文第一作者为复旦大学博士生张丕兰，高分子科学系为第一完成单位，文章链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.macromol.4c02108